文章摘要:为了优化和筛选谷子中高效的CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9）基因编辑系统，针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因（SiPDS）设计6种gRNA（gRNA1—gRNA2针对外显子1，gRNA3—gRNA6针对外显子12）构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过聚乙二醇介导的方法转入谷子原生质体，然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS的突变效率。结果表明，采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高，为50.44%～57.36%。将Super启动子（SP）、谷子内源的泛素启动子（Ubi）分别驱动Cas9的基因编辑系统转入谷子原生质体，发现两者对SiPDS基因的突变效率分别为0.5%、5.5%。随后采用Ubi启动子驱动Cas9，比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS基因的突变效率，发现双gRNA 基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66和1.11倍；tRNA基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了5.87倍，为51.23%，且Ubi-tRNA可同时针对多个位点进行编辑，其多位点突变频率为3.23%。比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白（RNP）复合物的体外切割活性，发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高，其对SiPDS基因的突变效率是2%，并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失。

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论文分类号:S515